Aprotinine CAS 9087-70-1

Aprotinine78R2S7, formule moléculaire C284H432N84O, CAS 9087-70-1, c'est un inhibiteur de protéase qui peut inhiber la trypsine et la chymotrypsine, empêcher l'activation d'autres protéasomes actifs dans le pancréas et l'auto-activation du trypsinogène. Cliniquement utilisé pour la prévention et le traitement de la pancréatite aiguë, des saignements causés par la fibrinolyse et de la coagulation intravasculaire disséminée. Il peut également être utilisé pour un traitement anti-choc. Les inhibiteurs de protéase sont des substances qui peuvent se lier aux enzymes et réduire le taux de dégradation du substrat. Les inhibiteurs de protéase dotés de propriétés protéiques sont largement présents, et deux types d'inhibiteurs de protéase dotés de propriétés protéiques ont été isolés du soja : l'inhibiteur de trypsine Kuniz et l'inhibiteur de Baumann Bellck. Le premier a un poids moléculaire de 20 à 25 ku, tandis que le second a un poids moléculaire de 8 ku.

Recombinantaprotinine(RTI16) peut inhiber la kininase et la trypsine et est un inhibiteur naturel non spécifique de la sérine protéase -. Il s'agit d'une protéine basique à chaîne unique composée de 58 résidus d'acides aminés, avec 3 liaisons disulfure réticulées-dans la chaîne. L'aprotinn est utilisé depuis longtemps pour le traitement de la pancréatite aiguë. Après les années 1990, l’aprotinne recombinante a commencé à être utilisée en chirurgie cardiothoracique pour protéger les plaquettes, réduire les saignements et l’exsudation, ainsi que pour le traitement clinique des patients souffrant de troubles de la coagulation. Par conséquent, la taille du marché de l’aprotinn s’est rapidement développée et est devenue l’un des médicaments biochimiques les plus importants.

Synthèse

 

À l'heure actuelle, les préparations d'aprotine recombinantes disponibles dans le commerce sont principalement des extraits d'organes tels que les poumons de bovins, qui nécessitent des processus complexes et des coûts élevés. Il est donc très important d’explorer la production d’aprotinne recombinante à l’aide de méthodes de génie génétique.

Lors de l'utilisation d'un système d'expression de sécrétion, la production d'aprotinne est généralement faible et l'activité du produit résultant est également faible. Grâce à l'expression par fusion, on s'attend à ce qu'elle augmente considérablement le niveau d'expression de l'aprotinne recombinante.

 

Un plasmide d'expression d'aprotinne recombinant pGrxA BPTI a été construit à cet effet, et un site de reconnaissance pour FXa a été conçu entre le partenaire de fusion et l'aprotinn recombinant. Après avoir été exprimé sous forme de corps d'inclusion, le partenaire de fusion a été purifié et replié par filtration sur gel. Le partenaire de fusion a été excisé par FXa pour obtenir une protéine ayant la même activité que le produit naturel. Grâce à l'optimisation des conditions d'expression, le rendement a été considérablement amélioré par rapport aux systèmes d'expression précédents.

Optimisation de l’expression des bactéries d’ingénierie :

 

Inoculer les bactéries en tube de glycérol sur des plaques de gélose LB/AMP, cultiver à 37 degrés pendant 20 heures, gratter les colonies et les inoculer dans 5 mL de milieu liquide LB/AMP à 37 degrés, 200 tr/min, et cultiver pendant la nuit. Inoculer 5 % de l'inoculum dans 100 mL de milieu de bouillie de maïs, cultiver à 37 degrés et 220 tr/min sur un shaker, induire pendant 7 heures, puis centrifuger (8 000 tr/min, 5 min, 4 degrés) pour collecter les cellules bactériennes. Peser le poids humide des cellules bactériennes et détecter leur expression par 15 % SDS-PAGE.

Culture en cuve de fermentation

 

Culture en cuve de fermentation :

Utilisation d'une cuve de fermentation allemande Biostat de 30 L, à 37 degrés, avec de l'oxygène dissous contrôlé à 20 %, pH 7,0. En utilisant une cuve de fermentation pour exprimer la protéine de fusion, 260 g de cellules bactériennes humides ont été obtenus à partir de 16 L de bouillon de fermentation, soit environ 16 g/L ; Le niveau d'expression est d'environ 45%,

Rupture de paroi et acquisition de corps d'inclusion de cellules bactériennes :

 

Une fois la culture terminée, collecter les cellules bactériennes, ajouter 1 g de cellules bactériennes à 10 mL de solution A (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), les suspendre soigneusement, soniquer les cellules dans un bain de glace, travailler 30 secondes, intervalle de 10 secondes, puissance 400 W, 30 cycles. Transférez le liquide dans un tube à centrifuger, centrifugez à 4 degrés et 8 000 tr/min pendant 15 minutes, et le précipité est le corps d'inclusion brut.

Préparation de la solution de dissolution des corps d'inclusion :

 

Laver le corps d’inclusion brut avec la solution B (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1 % Triton-X100) deux fois, à chaque fois pendant 0,5 heure, centrifuger pour éliminer le surnageant et obtenir des corps d’inclusion relativement purs. Ajouter 1 g de corps d'inclusion à 5 mL de solution C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L d'urée, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), incuber toute la nuit à 4 degrés, dénaturer et dissoudre, centrifuger à 12 000 tr/min pendant 15 min, et collecter le surnageant pour obtenir la solution de dissolution des corps d'inclusion. Obtenez de l'aprotinn recombinant.

Effets pharmacologiques :

 

 

Aprotinineinhibe la trypsine humaine, l'enzyme fibrinolytique, le plasma et l'angiotensine tissulaire grâce à des complexes d'inhibiteurs d'enzyme réversibles formés dans un certain rapport chimique. Les protéases ayant une activité sérine jouent un rôle majeur dans le système vasopressine kininogène kinine, le système du complément et le système de coagulation, où la plasmine et la vasopressine plasmatique jouent des rôles essentiels.

 

Aprotinn exerce son effet inhibiteur en formant un complexe d'aprotinn protéase via la partie active sérine de l'enzyme. Cependant, lorsqu’il est combiné avec différentes protéases, il présente des constantes de dissociation différentes. La liaison avec la trypsine est la plus forte (Ki=0.06nmoN), qui est l'une des constantes les plus basses signalées dans les interactions protéine-protéine (Laydunski et al. 1974). La liaison avec l'enzyme fibrinolytique humaine n'est pas très forte. En raison de la valeur K élevée du complexe inhibiteur enzymatique (Ki=1 nmoN), il peut être réversible (Wimann, 1980) et le complexe qui se lie à l'angiotensine plasmatique humaine est assez faible (Ki=30 nmol/l), mais reste dans la plage thérapeutique de l'aprotinn (Nakahara, 1983).

 

Aprotinn se lie non seulement aux molécules d'enzymes libres, mais également aux enzymes déjà liées à un troisième composant (si le centre actif de l'enzyme a encore une capacité de liaison). Par conséquent, l'aprotinn inhibe les enzymes fibrinolytiques libres et peut également inhiber le complexe intermédiaire de fibrinolysine chaîne kinase formé au cours d'un traitement thrombolytique avec la chaîne kinase (Wimann, 1980).
L'effet antifibrinolytique de l'aprotinn repose sur l'inhibition de la plasmine activée par l'hydrolyse des protéines. Contrairement aux solvants anti-fibrinolytiques synthétiques, en raison de son inhibition directe de la plasmine suractivée, l'aprotinn protège non seulement le substrat direct (fibrine) de la dégradation par la plasmine, mais protège également le fibrinogène, les facteurs V et VIII dans le plasma et l'alpha 2-globuline dans le sérum.

 

Dans les expériences de choc induit par les endotoxines et de choc hypovolémique, le Trasylol peut inhiber de manière significative l'activation du kininogène. (Masion et al., 1972).
Le trasylol peut prévenir ou retarder le développement d'un œdème interstitiel pulmonaire (poumon de choc). Son effet inhibiteur dépend de la dose-et du temps-dépendant (Lorthioir et al., 1973).
Pendant le choc, le pancréas ischémique peut produire une substance peptidique hautement toxique, à savoir le facteur inhibiteur du myocarde (MDF). Ce facteur est étroitement lié au décès par choc.

 

Le MDF peut être détecté dans le plasma des souris, des chiens, des singes et des humains présentant un choc hémorragique, septique, cardiogénique et un choc de brûlure. Le MDF peut provoquer une diminution de la contractilité du myocarde dans tous les cas de saignement, et en même temps, il provoque la contraction des vaisseaux de résistance viscérale, conduisant à une ischémie locale et à la production de davantage de MDF. De plus, en raison des dommages toxiques causés au système réticuloendothélial, son élimination dans le sang est retardée. Le trasylol peut grandement empêcher la production de MDF (Lefer 1984).

Aprotinine, en tant que composé à petites molécules qui résiste à la fibrinolyse, présente des propriétés inhibitrices enzymatiques significatives et spécifiques. Non seulement il inhibe efficacement l'activité de la trypsine, mais il agit également largement sur d'autres enzymes protéolytiques apparentées, jouant ainsi un rôle important dans les expériences de biologie cellulaire. En particulier pendant la lyse et l'homogénéisation des cellules et des tissus, Aprotinn peut servir d'inhibiteur efficace de protéase, empêchant efficacement la dégradation accidentelle des protéines cibles, ce qui est crucial pour maintenir l'intégrité et la précision des échantillons.

L'effet inhibiteur d'Aprotinn montre une nette dépendance à la dose, c'est-à-dire qu'à mesure que sa concentration augmente, l'effet inhibiteur sur l'activité fibrinolytique augmente également en conséquence. Cette fonctionnalité permet aux chercheurs de contrôler plus précisément les conditions expérimentales pour obtenir des résultats expérimentaux plus fiables et reproductibles. Parallèlement, Aprotinn peut également prolonger le temps de coagulation du sang, confirmant ainsi son rôle important dans le mécanisme de coagulation. Des expériences in vitro ont montré qu'Aprotinn est un inhibiteur efficace de la voie de coagulation endogène qui peut interférer et réguler les processus clés du processus de coagulation.

Aprotini a également démontré ses effets pharmacologiques uniques. Il peut inhiber de manière significative le processus de dissolution des caillots sanguins in vitro, prolonger le temps de saignement par coupe de queue chez les rats et prolonger le temps de coagulation dans le plasma humain. Ces résultats suggèrent qu'Aprotinn pourrait avoir des effets antihémorragiques et antithrombotiques potentiels. Pour valider davantage son effet in vivo, les chercheurs ont mené des expériences sur un modèle de court-circuit artérioveineux de rat. Les résultats ont montré qu'Aprotnin peut réduire considérablement le poids des caillots sanguins, renforçant ainsi son potentiel en tant que médicament antithrombotique.

En résumé, l'Aprotnin, en tant que composé à petites molécules qui inhibe la fibrinolyse, a démontré des propriétés inhibitrices enzymatiques et des effets pharmacologiques significatifs in vitro et in vivo. Son application dans les expériences de biologie cellulaire fournit aux chercheurs des outils puissants, tandis que ses résultats dans les études in vivo fournissent des indices importants et une base pour son développement en tant que médicament anti-hémorragique et antithrombotique. À l’avenir, grâce à des recherches plus approfondies sur le mécanisme d’action de l’Aprotnin et à des essais cliniques, nous devrions voir son application plus large dans le domaine médical.

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